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本制品是基于荧光探针检测的即用型RT-PCR试剂盒，可以对靶RNA分子进行实时定量RT-PCR分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。产品含有经过优化的缓冲液组分、逆转录酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA稳定剂、dNTPs、MgCl₂和稳定剂等所有实时定量RT-PCR所需要的成分，用户只需加入RNA模板、引物和探针即可进行探针法实时定量RT-PCR反应，具有广泛的用途。

• 用户只需准备模板、引物、探针和ROX染料（取决于qPCR仪器）即可以进行探针法实时定量RT-PCR实验，非常方便快捷，降低了操作误差。
  
• 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。灵敏度最高时可以达到50拷贝/反应（跟模板质量，引物设计等相关）。
  
• 既可用于TaqMan探针qRT-PCR，也可以是分子信标（molecular beacon）的qRT-PCR。
  
• 灵敏度和专一性比染料法荧光定量RT-PCR更高。
  
• 可用于基因表达分析、SNP分析、拷贝数分析等实验。也可以用于定性检。

组分	规格
2×探针法qRT-PCR缓冲液	500μL
10×探针法qRT-PCR酶混合液	100μL

保存：-20℃，有效期1年。


本试剂盒足够满足100次20μL体系的探针法qRT-PCR反应。


RNA模板、引物、TaqMan探针、超纯水。


一、配制反应体系
如果有N个样品并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个是做标准曲线的阳性对照，一个是阴性对照(NC)。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照(PC)，用户自己需要根据下表进行适当修改(把6个标曲反应改成1个阳性对照反应)。

成分	N个样品管	6个标准曲线管	NC管
2×探针法qRT-PCR缓冲液	各10μL	10μL	10μL
自备引物1(10μM)	各1μL	各1μL	1μL
自备引物2(10μM)	各1μL	各1μL	1μL
N个自备模板RNA	各1～2μL	不加	不加
自备阳性对照模板（6个梯度）	不加	各1μL(1管加1个梯度)	不加
阴性对照模板(水)	不加	不加	1μL
自备探针(5μM)	各1μL	各1μL	1μL
自备50×ROX	各0.4μL	各0.4μL	0.4μL
10×探针法qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL
超纯水	至20μL	至20μL	至20μL

• 关于ROX，下列信息仅供参考，具体以qPCR仪器的使用手册为准。
  ① 不需要ROX的机型：AgilentMX3000和MX4000、iCycler IQ、LightCycler480、SmartCycler System、Thermal Cycler Dice RealTime System等型号的荧光PCR仪器不需要加ROX染料，但加入的话也不会影响整个PCR分析
  ② 需要使用ROXI的机型：ABIPrism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。
  ③ 需要使用ROXII的机型：ABIPrism7500、7500Fast、MJ Opticon、MJChromo4、CorbettRotorGene3000。

二、反应程序
放入荧光PCR仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考，一定需要根据靶分子长度，引物和探针的Tm值、标记染料的种类等进行调节。一般选择三步法PCR，盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：

步骤	温度	时间
逆转录	50℃	30min
预变性	94℃	2min
PCR反应 (45个循环)	95℃	15sec
	60℃	60sec(采集FAM通道的荧光 信号，淬灭基团为TAMRA)

三、数据处理
如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性。一般情况下，阴性对照Ct大于或等于40（阈值需要以阴性对照的Ct值确定，此处为便于叙述以40为例，具体情况很可能阈值不一样）。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
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